產(chǎn)品名稱(chēng)：產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針?lè )?
英文名稱(chēng)：Multiplex PCR Detection Kit for Enterotoxigenic E.coli (Fluorescent Probe Assays)
產(chǎn)品編號與包裝規格：
| 編號 | 規格 |
| FZ019BF2 | 48 測試/盒 |
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：本試劑盒僅適用于食品樣本中產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC 的定性檢測。
檢測原理：基于 Real Time PCR 技術(shù)，利用針對腸桿菌科的16S rRNA 基因和ETEC的毒力基因 stp、sth、lt 設計的引物、熒光探針以及其他反應優(yōu)化配置所需試劑，加入待檢樣品即可進(jìn)行擴增反應。在發(fā)生擴增過(guò)程中，熒光探針與目的基因片段結合，可被 Taq 酶分解并產(chǎn)生熒光信號，此時(shí)熒光定量 PCR 儀可識別該熒光信號，同時(shí)根據其強弱變化繪制出相應的實(shí)時(shí)擴增曲線(xiàn)，進(jìn)而判定產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC 的類(lèi)型。
stp、sth、lt、16S rRNA 基因分別對應熒光報告基團 FAM、VIC、ROX、Cy5。
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針?lè )?產(chǎn)品組分：
儲存條件與保質(zhì)期：-20℃避光儲存，有效期為 12 個(gè)月，避免反復凍融。
靈敏度：單通道最低檢驗限達到 100 CFU/Test
所需其他材料和適用儀器：熒光定量 PCR 儀（具有能夠檢測 FAM、VIC、Cy5、ROX 標記的熒光通道）、高速離心機、移液器、移液槍頭及離心管等。
產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌 ETEC核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針?lè )?使用指南：
1，樣品前處理
1) 參照 GB 《4789.6?2016》，使用 1μL 接種環(huán)刮取新鮮培養的待鑒定的可疑菌落到含 30 μL 裂解液的無(wú)菌離心管中，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱 10 min；
2) 12000 r/min 離心 15 min，上清即為粗提的 DNA，可轉移至 0.2 mL 無(wú)菌離心管中，在-20℃下可長(cháng)期保存。也可以選擇商業(yè)化的細菌基因組提取試劑盒進(jìn)行提取。
2, 加樣、反應
1) 按照需求取 n 個(gè) PCR 反應管（n=1 管陰性對照+待檢測樣品數+1 管陽(yáng)性對照），從試劑盒中取出預混液，充分融化，渦旋后短暫離心，以上每管加入 20 μL 預混液，待用。
2) 向上述 n 個(gè)反應管中分別加入陰性對照、待測樣品 DNA、陽(yáng)性對照各 5 μL，總反應體積為 25 μL。蓋緊管蓋，短暫離心，立即進(jìn)行 PCR 擴增反應。
3) PCR 反應體系為 25 μL，取 FAM、VIC、Cy5、ROX 檢測通道，在反應階段 2 中59℃時(shí)收集熒光信號，具體程序如下：
| 反應階段 | 溫度 | 時(shí)間 | 信號收集 | 循環(huán)數 |
| 1 | 95°C | 1 min | 1 | |
| 2 | 95°C | 10 sec | } 40 | |
| 59°C | 40 sec | ? |
注：在反應階段 2 中 59℃時(shí)收集熒光信號，對于多通道熒光 PCR 儀，取熒光素 “FAM”、“VIC”、“Cy5”、“ROX”為信號采集通道，淬滅基團選擇“None”，染料校正選擇“None”。
3, 結果：一般情況下，可通過(guò)軟件自動(dòng)設定的基線(xiàn)、閾值等直接讀取檢測結果。如需調整，可根據所使用儀器的自身情況（如噪聲等）以及選取的不同熒光通道進(jìn)行調整。
1) 質(zhì)量控制：陰性對照未出現明顯的 S 型擴增曲線(xiàn)或 Ct 值＞37，陽(yáng)性對照出現 S 型擴增曲線(xiàn)且其 Ct 值＜30。若陰陽(yáng)性對照不同時(shí)滿(mǎn)足上述條件，則本次檢測結果無(wú)效，應重新檢測或與產(chǎn)品技術(shù)支持聯(lián)系。
2) 結果判讀：（根據反應所得 Ct 值判讀，具體見(jiàn)下表：）
| Ct值 | 判讀結果 |
| ≤35 | 對應的基因陽(yáng)性。 |
| 35~37 | 建議重新檢測，若復測結果 Ct≥37，則對應的基因陰性，反之為陽(yáng)性。 |
| ≥37 | 對應的基因陰性。 |
? 一般豬源的 ST 基因和人源的 ST 基因在分離的菌株中只存在其中一種，特殊情況下除外。
? 陰性對照反應 16S rRNA 基因可能會(huì )有弱陽(yáng)性現象，不作為陽(yáng)性結果判定依據。
? 多重 qPCR 檢測可能出現不同熒光通道之間競爭抑制的問(wèn)題，單基因分析時(shí)適當調整閾值線(xiàn)。
